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熒光-PCR法的主要理論依據(jù)說明

更新時間:2021-04-08點(diǎn)擊次數(shù):1520
   熒光-PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程。PCR擴(kuò)增時加入一對引物和一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,淬滅基團(tuán)抑制報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射。剛開始時,探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離,抑制作用被解除,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一次熒光強(qiáng)度信號,這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析進(jìn)而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線分熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期三個階段。指數(shù)期的PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,因此我們選擇在這個階段進(jìn)行定量分析,計(jì)算出待測樣品初始模版的量。
  熒光-PCR法的理論依據(jù)是什么?
  特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大,則指數(shù)擴(kuò)增過程越短,當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后,則無論原來樣品中起始模板含量多少,終擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的。理想的擴(kuò)增結(jié)果:Y=X×2n;其中:Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量,X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù),n為擴(kuò)增次數(shù);理論上PCR擴(kuò)增效率為100,PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長,但實(shí)際上DNA的每一次復(fù)制都不*,即每一次擴(kuò)增中,模板不是呈2的倍增長;實(shí)際應(yīng)為:Y=X(1+E)n,其中:E代表擴(kuò)增效率,E=參與復(fù)制的模板/總模板,通常E≤1,E在整個PCR擴(kuò)增過程中不是固定不變的。通常X在1-105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時,E相對穩(wěn)定,原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加,適合定量分析,這也就是所謂的指數(shù)期;隨著循環(huán)次數(shù)n的增加(>30次),E值逐漸減少,Y呈非固定的指數(shù)形式增加,后進(jìn)入平臺期。

TEL:021-61210612

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